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    小分子量蛋白該如何做好WB?
    瀏覽次數:1657發布日期:2022-07-07

    相信經常做WB的實驗汪們經常會頭疼,郁悶。有些蛋白指標一次就能做成功,而有些指標做無數次都是失敗,導致吃不香,睡不下。蛋白分子量過大或過小都不易做,我們就來聊下小分子量蛋白如果成功做出WB。

    一、上樣量

    通常Western Blot每孔上樣量為30-50μg,80%蛋白在細胞中的含量很低,當蛋白分子量過小時,上樣量建議選擇50-100μg。畢竟對 于小分子的蛋白來說,在跑電泳時,稍不留心,蛋白就跑沒影了。

    二、凝膠電泳

    1.選擇合適膠濃度。分子量小的蛋白,建議配置5%的濃縮膠,分離膠濃度參考下表。
    分子量(kDa)分離膠濃度
    X≤1015%
    10<X≤1513.5%
    15<X≤2512%


    2.電泳電壓太大會導致跑在面的小分子蛋白成鋸齒狀,建議濃縮膠用80V 30分鐘,之后調成100V, 溴酚藍跑到距膠底1cm以上就停下,不要跑到底,否則目的蛋白可能跑出去了。

    三、轉膜

    1.膜的選擇。免疫印跡中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF 膜等。推薦選用 PVDF 膜(聚偏二氟乙烯),因為蛋白質與 PVDF 膜以疏水力結合,從而將親水部位暴露到液相,使抗體更容易與之結合。
    針對不同分子量的蛋白質,PVDF 膜有兩種規格:0.45 μm 的膜適合檢測 MW > 20 kDa 的蛋白質,0.2 μm 的膜適合檢測MW < 20 kDa 的蛋白質,而且0.2 μm 的膜可以有效防止蛋白質在轉移過程中直接穿透過膜。PVDF 膜使用之需要在甲醇中浸泡 5min 后再轉入轉移液中,PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質結合。
     
    2.轉膜方式。對于小分子蛋白,電流太大或時間太長容易轉過。轉膜采用濕轉,條件參考下圖。
    分子量(kDa)轉膜條件
    X≤10恒流200mA,30min
    10 < X≤15恒流200mA,40min
    15< X≤20恒流200mA,50min
    3.轉膜的平衡時間短點,幾分鐘甚至1min就好。平衡所用的液體及轉膜液成份相同,都不要加SDS,效果是天壤之別。

    四、轉膜后用麗春紅染色,測定蛋白豐度。
     
    PVDF膜經麗春紅染色后,可以檢測出樣品電泳過程中呈現印跡的大小,通過各個泳道上樣品印跡的對比,可以初步判斷上樣量的準確性。 

    五、一抗的稀釋比例。
     
    通??贵w的說明書上都會給出一定的稀釋比例對于分子量過小的蛋白來說,一抗應選擇低的稀釋比例,這樣有助于抗體的結合。 
     
    六、顯影要把握曝光時間。
     
    根據信號的強弱適當調整曝光時間,如果在暗處馬上可以看到條帶,建議曝光時間在30s-2min內完成,如果信號較弱,滴加顯影液后條帶不會很清晰,可以把膜拿出來放一邊讓它反應一會,然后再放回機器里面,重新滴加顯影液顯影,效果就會好不少。還有適當延長顯影時間,就能獲得清晰的條帶。

    以上就是關于小分子量蛋白WB實驗的一些經驗建議,希望對還被小分子量蛋白WB折磨的朋友們有幫助。
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